Техника исследования морфологии крови - медицинская статья, новость, лекция

Кровь представляет собой промежуточную среду, состоящую из жидкой плазмы и взвешенных в ней форменных элементов (красных и белых кровяных телец и пластинок), с помощью которой совершаются процессы обмена. В 1 мм² крови насчитывается нормально у женщин в среднем 4 500 000 (с предельными колебаниями от 4 000 000 максимально до 5 000 000), у мужчин в среднем 5 000 000 (с колебаниями от 4 500 000 до 5 500 000) эритроцитов; лейкоцитов - 6000-8000 (с колебаниями минимально до 5000 и максимально до 9000) и от 120 000 до 350 000 - тромбоцитов.

Необходимая для исследования кровь берется обычно при помощи укола в мякоть пальца. Палец предварительно обмывают мылом и водой, а затем спиртом и эфиром.

Морфологическое исследование крови производится в мазках, приготовляемых на предметных или покровных стеклах и окрашенных по одному из указанных ниже способов. Для получения хороших мазков необходимо соблюсти ряд технических условий и первое из них - чистоту и тщательность обезжиривания стекол. Для этого следует тщательно промытые водой стекла погрузить, по крайней мере на час, в смесь спирта с эфиром, после чего хорошо обмыть их дистиллированной водой и обсушить. Мазок должен быть тонким, равномерным и не достигать краев стекла, для чего стекло, употребляющееся для размазывания крови, должно быть достаточно тонким и иметь шлифованные ребра. Предметным стеклом, недалеко от его края, касаются выступившей на месте прокола кожи капли крови так, чтобы маленькая капля осталась на предметном стекле. Другое шлифованное стекло, поставленное коротким ребром под углом в 45° к первому впереди капли, подводят к капле крови, которая в силу капиллярности расплывается вдоль ребра. Тогда легким и быстрым движением стекла вперед кровь размазывают тонким слоем по предметному стеклу (рисунок 1).

Рисунок 1. Схема производства мазка крови на предметном стекле

Мазки приготавливаются также и на покровных стеклах. Для этого, прикоснувшись покровным стеклом к выступившей из места укола капле крови, наносят очень маленькую каплю крови на стекло, которое накладывается на другое покровное стекло так, чтобы углы наложенного стекла приходились на середину ребер нижнего. Капля очень тонким слоем распределяется между стеклами, и тогда последние, захваченные за кончики, разводят и получают два тонких препарата (рисунок 2).

Рисунок 2. Схема производства мазка крови на покровных стеклах

Мазок высушивают на воздухе и на его середине иглой обычно отмечают фамилию исследуемого и дату.

Окрашивание сухих мазков производят после предварительной фиксации. Лучшая фиксация достигается в абсолютном метиловом алкоголе в течение трех минут или смеси Никифорова, состоящей из равных частей абсолютного этилового алкоголя и эфира в течение 10-30 минут в зависимости от толщины мазка.

Тонкое морфологическое исследование крови с помощью светового микроскопа возможно только на окрашенных препаратах. Принцип всех предложенных для этой цели окрасок основан на химическом сродстве различных составных частей клетки к определенным красящим веществам, обычно к анилиновым краскам, и в меньшей мере на их физических свойствах.

Ядро, содержащее в значительном количестве нуклеиновые кислоты, главным образом дезоксирибонуклеиновую, связывает преимущественно основные краски (метиленовую синь) и в меньшей мере кислые и, таким образом, окрашивается амфофильно. Протоплазма также окрашивается амфофильно, но связывает преимущественно кислые краски (эозин) и в меньшей степени щелочные. Если нет химического сродства частей клетки с красящими веществами, то есть не происходит по Паппенгейму связывания наподобие соли с диссоциированной частью красящего вещества, то все же части клетки окрашиваются проникшим в зависимости от различных физических свойств красящим веществом чисто физически, то есть не в цвет первоначальной красящей соли, а в измененный цвет (нюанс) освобожденного из диссоциированного красящего вещества карбинолового основания - метахроматически.

Принцип дифференциальной окраски разработан отечественным ученым Д.Л. Романовским. Из множества предложенных для этой цели окрасок наилучшими являются окраска по Романовскому - Гимза (Giemsa) и Май - Грюнвальд - Гимза (May - Grunwald - Giemsa) по Паппенгейму. Краска Гимза состоит из метиленазура (Azur I), эозина и метиленовой синьки, растворенных в метиловом алкоголе и глицерине. В щелочном растворе метиленовой синьки через некоторое время отщепляется другое красящее вещество, которое придает раствору фиолетовый оттенок и которое можно извлечь из раствора хлороформом в виде ярко-красной краски. Нохт (Nocht) считал это новое красящее вещество щелочным продуктом разложения метиленовой синьки и назвал его "красное из метиленовой синьки". В дальнейшем было доказано (Михаэлис - Miechaelis), что краска метиленазур или азур I получается действием щелочи на метиленовую синьку. Д.Л. Романовский и Гимза показали, что обладающие сродством к метиленазуру, имеющему амфофильную реакцию, части клетки окрашиваются в ярко-красный цвет не самим азуром, а соединением эозина с азур I, то есть эозиновой солью метиленазура. Смесь равных частей азур I и метиленовой синьки называется часто азур II. Отсюда краска Гимза обозначается часто как азур II - эозин по Гимза и состоит из: Azur II - 3,0; Eosin В (желтый) - 0,8; Clycerini - 250,0; Alcohol methyl - 250,0.

Рабочий раствор краски (из продажной готовой краски) приготавливают из расчета 1,5 капли на 1 мл дистиллированной воды. После фиксации окраску в течение 25-30 минут лучше всего производить в чашках Петри, где стекла укладываются на стеклянных палочках, намазанной стороной вниз, так как при этом осадок из краски оседает на дно чашки и не загрязняет мазка. По истечении 25-30 минут мазки извлекают, промывают водой и высушивают на воздухе. Краска очень хорошо дифференцирует ядро, но значительно хуже нейтрофильную зернистость протоплазмы. Этот недостаток устранен в комбинированной окраске Май - Грюнвальд - Гимза по Паппенгейму. Краска Женнера (Jenner) - Май - Грюнвальд представляет собой раствор эозиновокислой метиленовой синьки в метиловом алкоголе (0,5 порошка готовой краски на 100 г чистого метилового алкоголя и 50 г чистого глицерина).

Так как краска приготовлена на метиловом алкоголе, то предварительная фиксация препарата не нужна. Мазок покрывают неразведенной краской Май - Грюнвальд и фиксируют таким образом в течение трех минут, затем к покрывающей мазок краске добавляется равное количество воды (если, например, краски было употреблено 10 капель, то и воды надо прибавить 10 капель). Далее мазок окрашивают в течение 1 минуты. Краску сливают и препарат докрашивают, как было указано выше, раствором краски Гимза в течение 10-15 минут, после чего промывают водой.

Окраска препаратов, приведенных в таблицах атласа, производилась упрощенным способом. Краска готовилась из эозиновокислой метиленовой синьки из расчета 0,1-0,15 порошка на 100 мл метилового алкоголя без прибавления глицерина. Препараты фиксировались этим раствором в течение двух минут; краску сливали, мазки промывали водой и окрашивали снова раствором, разведенным вдвое дистиллированной водой в течение двух минут. Затем мазки опять промывали водой и докрашивали краской Гимза под контролем микроскопа, так как они докрашивались краской Гимза очень быстро и в зависимости от разных причин не всегда за один и тот же промежуток времени.