0
Для количественного определения факторов свертывания VIII и IX устанавливается каолин-кефалиновое время разведенной бедной тромбоцитами плазмы крови больного и стандартной контрольной плазмы, полученной от группы здоровых лиц.
Обусловленное разведением снижение концентрации всех плазменных факторов свертывания, кроме исследуемых, компенсируется добавлением плазмы крови больного с заведомо известным выраженным дефицитом факторов VIII и IX. В качестве активаторов используются кефалин или другие заменители фактора III тромбоцитов и каолин. Добавление кефалина (эритрофосфатида) исключает нарушения свертывания тромбоцитарного генеза и делает метод чувствительным к дефициту плазменных факторов свертывания и к избытку в плазме антикоагулянтов. Каолин используется для активации контактной фазы свертывания. В результате на показаниях теста отражается лишь дефицит исследуемого фактора. При помощи стандартной кривой разведения определяется степень дефицита факторов VIII и IX.
Используемые реактивы
Для количественного определения факторов свертывания VIII и IX используются следующие реактивы:
- Субстратная дефицитная плазма. Используется бедная тромбоцитами плазма крови больных тяжелыми формами гемофилии А и В с установленным резко выраженным дефицитом факторов VIII и IX. (1-3%) получаемая при центрифугировании крови в течении 15 минут при 2000 g. В качестве консерванта используют 3,8-процентный раствор цитрата натрия (9:1). Для получения больших количеств субстратной плазмы целесообразно провести больным тяжелой формой гемофилии А и В плазмаферез, позволяющий получить 250 мл плазмы из 500 мл крови больного.
- Стандартная плазма. Контрольную бедную тромбоцитами плазму заготавливают так же, как и плазму крови исследуемых больных и субстратную плазму. Поскольку у здоровых лиц содержание в крови факторов VIII и IX колеблется в значительных пределах, целесообразно использовать пул донорской плазмы, состоящий из равных объемов 10-20 образцов плазмы крови здоровых лиц. Образцы стандартной и субстратной плазм хранятся не более трех часов при 4°С или в течение 1 месяца при -20°С
- Взвесь каолина (белой глины) в эритрофосфатиде. Используется 0,1-процентный раствор эритрофосфатида в изотоническом растворе (0,85) хлорида натрия. Готовится взвесь 0,025 г каолина (для его измельчения используется лабораторная агатовая ступка) в 0,5 мл 0,1% раствора эритрофосфатида и объем доводится до 5 мл изотопическим раствором хлорида натрия. Полученную взвесь перемешивают в течение 10 минут на магнитной мешалке при комнатной температуре.
- Имидазольный буфер pH 7,4 готовится из концентрата (5 мл концентрата + 95 мл дистиллированной воды).
- Раствор хлорида кальция 0,025 моль/л.
Ход определения
| Разведения, мл |
1-9 1:10 |
1-19 1:20 |
1-39 1:40 |
1-99 1:100 |
1-199 1:200 |
| % фактора VIII, IX | 100% | 50% | 25% | 10% | 5% |
Все образцы плазм сохраняются на льду в течение всего времени исследования. Определение проводится в стандартных условиях pH (имидазольный буфер), контактной (каолин) и фосфолипидной (кефалин или эритрофосфатид) активации процесса свертывания. В центрифужные пробирки, установленные на водяной бане (37°С), последовательно вводят но 0,1 мл разведенной буфером нитратной плазмы больного (1:10), субстратной плазмы и взвеси каолина в эритрофосфатиде. Содержимое пробирок тщательно перемешивают и инкубируют на водяной бане в течении 3 минут. Затем вводят 0,1 мл раствора хлорида кальция и определяют время свертывания.
Построение калибровочной кривой
Для построения кривой используют указанные выше разведения стандартной плазмы.
Чтение результатов
Время свертывания стандартной контрольной плазмы, разведенной имидазольным буфером в соотношении 1:10 принимается за 100%. На билогарифмической бумаге по оси ординат откладывают время свертывания в секундах, а при оси абсцисс уровень дефицитного VIII или IX фактора в процентах. Угол наклона кривой зависит от качества субстратной плазмы. Нормальное значение факторов VIII и IX составляет 70-200%.
Метод используется для диагностики дефицита факторов VIII и IX, определения тяжести гемофилии и контроля за заместительной терапией больных трансфузиями плазмы или концентратами соответствующих факторов свертывания.
Автор(ы): Lothr